Promotie Tess Meuleman,  LUMC
9 oktober 2018

Samenvatting Onderzoek

De zwangerschap is immunologisch gezien heel interessant. De foetus, die zowel genen van de moeder en vader draagt, is dus gedeeltelijk lichaamsvreemd voor de moeder, en wordt in een ongecompliceerde zwangerschap door het immuunsysteem van de moeder geaccepteerd en niet afgestoten. Tijdens de innesteling van de foetus, wordt het immuunsysteem van de moeder geactiveerd en de herkenning van de moeder van haar ongeboren kind is essentieel voor het verloop van een ongecompliceerde zwangerschap. Verschillende immunologische mechanismes spelen een belangrijke rol om maternale tolerantie ten opzichte van haar ongeboren kind te creëren. Men denkt dat een inadequate immuunreactie van de moeder richting de foetus verantwoordelijk is voor een gedeelte van de tot nu toe nog onverklaarde herhaalde miskramen. Men spreekt van herhaalde miskramen indien tenminste 3 opeenvolgende miskramen zijn opgetreden. In 1 tot 2% van de stellen met kinderwens is dit het geval. Een groot deel van de vrouwen met herhaalde miskramen heeft het antifosfolipiden syndroom maar in 50-75% van deze stellen wordt nog geen bekende oorzaak van de herhaalde miskramen gevonden. Gelukkig is in de loop van de jaren ontdekt dat bij vrouwen met herhaalde miskramen en antifosfolipidensyndroom de behandeling middels fraxiparine en aspirine de kans op een levend geboren kind vergroot. De gedachte is dat de antistoffen aanwezig bij antifosfolipidensyndroom zorgen voor een verhoogde afweer ook richting het ongeboren kind, waarschijnlijk zorgen fraxiparine en apirine dat deze reactie vermindert. In mijn proefschrift hebben we gevonden dat bij een gedeelte van stellen met onverklaarde herhaalde miskramen ook antistoffen aanwezig zijn, deze antistoffen richten zich tot de antigenen van het ongeboren kind afkomstig van de vader. Mogelijk hebben deze antistoffen hetzelfde effect als de antistoffen aanwezig bij vrouwen met antifosfolipidensyndroom en herhaalde miskramen. Het zou kunnen dat bij juist deze vrouwen ook fraxiparine en ascal een juiste behandeling zijn. We hebben tijdens mijn onderzoek in het LUMC een biobank opgezet waarbij we stellen met herhaalde miskramen nog steeds includeren zodat we kunnen onderzoeken wat de verschillende immunologische oorzaken kunnen zijn van de onverklaarde herhaalde miskramen. Ook includeren we stellen waarbij de vrouw antifosfolipidensyndroom heeft, het is namelijk nog steeds niet helemaal duidelijk waarom deze stellen meer kans hebben op herhaalde miskramen. Door dit te onderzoeken hopen wij ook voor stellen waarbij geen oorzaak gevonden wordt, uiteindelijk meer duidelijkheid te geven over de mogelijke oorzaak. Door het onderzoek voort te zetten bij vrouwen met herhaalde miskramen met en zonder antifosfolipiden syndroom, hopen wij meer antwoorden te krijgen welke immunologische interacties een rol spelen, en om diagnostische markers te kunnen identificeren die kunnen dienen als hulpmiddel in de keuze van therapie, toegespitst op de individuele patiënt.

Nederlandse samenvatting proefschrift

Het gunstige verloop van een zwangerschap is vanuit immunologisch perspectief gezien heel interessant. De foetus, die zowel maternale genen als paternale genen heeft en dus gedeeltelijk lichaamsvreemd is voor de moeder, wordt in een  ongecompliceerde zwangerschap door het immuunsysteem van de moeder  geaccepteerd. Dit terwijl een getransplanteerde donornier met dezelfde genetische verschillen zou worden afgestoten.
Bij het onderscheid tussen lichaamseigen en lichaamsvreemd spelen de Humaan Leukocyten Antigenen (HLA) een belangrijke rol. HLA-antigenen zijn moleculen die op het membraam van alle cellen voorkomen en waarvan er heel veel varianten zijn. Dit wordt ook wel polymorfisme genoemd. Tijdens de innesteling van de foetale cellen in de baarmoeder wordt het maternale immuunsysteem geactiveerd, maar het maternale immuunsysteem moet ook worden onderdrukt zodat de foetale cellen zich kunnen innestelen en niet afgestoten worden. Verschillende immunologische mechanismes spelen een rol bij het ontstaan van maternale tolerantie ten opzichte van haar ongeboren kind.
De gedachte is dat een inadequate maternale immuunreactie verantwoordelijk is voor een gedeelte van de tot nu toe nog onverklaarde herhaalde miskramen.^1,2 

Men spreekt van herhaalde miskramen indien tenminste 3 opeenvolgende miskramen zijn opgetreden. In 1 tot 2% van de stellen met kinderwens is dit het geval.³ Tot nu toe bekende oorzaken van herhaalde miskramen zijn uterus anomalieën, endocriene factoren, cytogenetische factoren, erfelijke trombofiliefactoren en antifosfolipiden syndroom.^4,5 Bij 50-75% van deze stellen wordt geen oorzaak gevonden en blijven de herhaalde miskramen onverklaard.⁶ Bij stellen met onverklaarde herhaalde miskramen zijn in de afgelopen jaren verschillende behandelingen uitgeprobeerd zoals immunotherapie, progesteron, HCG, aspirine, laag moleculair gewicht heparine en lage dosering insuline. Al deze behandelingen geven echter geen verbetering wat betreft  zwangerschapsuitkomst.^7-10 Zonder behandeling is de kans op een levend geboren kind bij stellen met onverklaarde herhaalde miskramen ongeveer 75%, al laten recente studies wisselende percentages zien tussen 57%-95%.^7,11-14 Ondanks dat de kans op een levend geboren kind hoog is, is de emotionele belasting en onzekerheid bij stellen met onverklaarde herhaalde miskramen groot. Een gedeelte van deze stellen zal ook nooit een levend geboren kind krijgen.

Het doel van dit proefschrift is om bij stellen met onverklaarde herhaalde miskramen de mogelijk onderliggende immunologische mechanismes te identificeren, waarbij we met name geïnteresseerd zijn in de interactie tussen het maternale immuunsysteem en de lichaamsvreemde vaderlijke HLA-antigenen. Door deze mechanismes beter te begrijpen hopen we in de toekomst effectieve en patiëntgerichte behandelingen te kunnen geven bij stellen met onverklaarde herhaalde miskramen.

In hoofdstuk 2 geven we een systematisch overzicht van de mogelijke rol die het HLA systeem speelt bij herhaalde miskramen. Eerdere studies tonen associaties aan tussen onverklaarde herhaalde miskramen en specifieke maternale HLA-allelen en tussen onverklaarde herhaalde miskramen en het delen van dezelfde HLA-allelen tussen stellen. Deze studies geven geen eenduidige resultaten onder andere door het gebruik van verschillende definities voor geïncludeerde cases en controles, analyses van verschillende HLA allelen, en het gebruik van verschillende technieken om HLA te typeren. In ons review includeerden we alleen studies die strikte inclusiecriteria gebruikten en waarbij de HLA-antigenen bepaald waren met moleculaire typering technieken. Ondanks deze strikte inclusiecriteria, is nog steeds sprake van grote selectie en informatie bias in de geselecteerde studies en zijn de gevonden associaties klein, zodat we geen definitieve conclusies kunnen trekken.

Op het foetale trofoblast komen maar een deel van de HLA-antigenen tot expressie zodat een verminderde allo-immuunreactie van het maternale immuunsysteem optreedt. Alleen het niet-klassieke oligomorfe HLA-G en HLA-E en maar een enkel klassiek HLA-gen, namelijk HLA-C, komen op het foetale trofoblast tot expressie. Aangezien het maternale immuunsysteem tijdens innesteling alleen in contact komt met deze antigenen, zijn wij in dit proefschrift geïnteresseerd in verschillende aspecten van deze antigenen bij stellen met herhaalde miskramen.
In hoofdstuk 3 beschrijven we genetische polymorfismen van HLA-G in vrouwen met herhaalde miskramen en vrouwen met een ongecompliceerde zwangerschap. We waren met name geïnteresseerd in een combinatie van verschillende polymorfismen omdat juist die combinatie zorgt voor de expressie van oplosbaar (sHLA) en membraangebonden vormen van HLA-G. We zagen inderdaad dat een combinatie van polymorfismen, leidend tot het HLA-G UTR-4 haplotype, significant minder vaak werd gevonden bij vrouwen met herhaalde miskramen. Dit suggereert dat HLA-G UTR-4 haplotype een belangrijke immunoregulatoire rol speelt bij een ongecompliceerde doorgaande zwangerschap.

Omdat HLA-C het enige klassieke HLA-gen is dat op de trofoblast tot expressie wordt gebracht, hebben we in hoofdstuk 4 gekeken of een maternale allo-immuunreactie tegen het HLA-C allel van de vader een rol speelt in onverklaarde herhaalde miskramen. We zagen een verhoogde frequentie van HLA-C *07, een van de meest immunogene HLA-C allelen, bij partners van vrouwen met herhaalde miskramen. Als gevolg hiervan werden meer mismatches gevonden voor HLA-C *07 tussen moeder en vader in vergelijking met paren met een ongecompliceerde zwangerschap. De incidentie van HLA antilichamen was ook verhoogd bij vrouwen met herhaalde miskramen in vergelijking met vrouwen met een ongecompliceerde zwangerschap.
Omdat de klinische relevantie van deze antilichamen tijdens de zwangerschap niet duidelijk is, hebben we in hoofdstuk 5 het effect van antilichamen op zwangerschapscomplicaties, waaronder herhaalde miskramen, onderzocht. De geselecteerde studies tonen een hoog niveau van statistische en klinische heterogeniteit als gevolg van het gebruik van verschillende screeningtechnieken, variërende tijdstippen van screening en gebruik van onjuiste controlegroepen. Bovendien ontbrak in de meeste geïncludeerde studies gedetailleerde analyse van de karakteristieken en specificiteit van deze antilichamen. Zoals we van onderzoek bij transplantatie weten zal maar een deel van de antilichamen afstoting veroorzaken, daarom is informatie over specificiteit, de potentie om complement te fixeren, titer van de antilichamen, en welke HLA-epitopen antilichamen herkennen essentieel. De rol van specifieke HLA-C antilichamen was nog niet onderzocht bij vrouwen met herhaalde miskramen, terwijl HLA-C toch het enige polymorfe klassieke HLA-antigen is dat op trofoblast tot expressie wordt gebracht. Daarom hebben we in hoofdstuk 6 gekeken naar de rol van specifieke HLA-C antilichamen bij vrouwen met herhaalde miskramen. De aanwezigheid, de specificiteit van HLA-antilichamen en de mogelijkheid om complement te binden werd bepaald in het eerste trimester van de volgende zwangerschap bij vrouwen met herhaalde miskramen en vergeleken met vrouwen met een ongecompliceerde zwangerschap. HLA-C antilichamen werden significant vaker gevonden bij vrouwen met herhaalde miskramen, wat suggereert dat deze antilichamen een rol kunnen spelen in een deel van de vrouwen met herhaalde miskramen. Omdat niet al deze HLA-C antilichamen complement konden binden, moet nog vastgesteld worden welk mechanisme precies betrokken is bij de etiologie, het binden van complement of antilichaam afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit.
In hoofdstuk 7 zagen we vaker C4d depositie in miskraamweefsel bij vrouwen met herhaalde miskramen in vergelijking met vrouwen met een sporadische miskraam en vrouwen met een electieve abortus. C4d is een biomarker voor klassieke complementactivatie, die in de regel plaats vindt door binding van antilichamen. C4d hecht aan cellen en weefsel en werkt daardoor als een marker van recente door antilichaam aangebrachte weefselbeschadiging.
Concluderend wijzen de gecombineerde resultaten van hoofdstuk 4, hoofdstuk 6 en hoofdstuk 7 erop dat bij een deel van de vrouwen met onverklaarde herhaalde miskramen, antilichaam-gemedieerde afstoting van het foetale allo-transplantaat een rol kan spelen.

Eerdere studies in muizen laten zien dat ten tijde van de geslachtsgemeenschap, al lang voordat de implantatie plaatsvindt, maternale tolerantie tegen foetale allo-antigenen optreedt.^15,16 Humaan semen bevat ook verschillende factoren zoals cytokinen, chemokinen,¹⁷ en sHLA,^18,19 die de maternale immuunreactie kunnen moduleren.^20,21 We laten in hoofdstuk 8 zien dat humaan semen inderdaad allerlei immuun regulerende factoren bevat, waaronder hoge concentraties TGF-β, IDO en sHLA klasse I. Tevens heeft humaan semen een immuun modulerend effect op T-cellen. Contact met semen leidde tot een verhoogde proliferatieve respons van T-cellen en de expressie van Foxp3, een marker voor regulerende T-cellen. Verder zagen we dat antigeen presenterende cellen nodig zijn om IL-10- en CD25 expressie te induceren op T-cellen na blootstelling aan humaan semen.
Zoals Koelman en anderen¹⁹ eerder beschreven, is contact met HLA-antigenen in semen via de orale mucosa een manier om tolerantie voor de vaderlijke HLA-antigenen van de foetus tijdens de zwangerschap te creëren.
In hoofdstuk 9 hebben we daarom gekeken of vrouwen met onverklaarde herhaalde miskramen minder vaak orale seks hebben in vergelijking met gematchte vrouwen met een ongecompliceerde zwangerschap. In deze gematchte case-controle studie is het hebben van minder orale seks geassocieerd met het optreden van herhaalde miskramen. Gezien de methodologische en statische problemen in dit hoofdstuk, kan echter nog  geen definitieve conclusie getrokken worden.

Concluderend laten we in dit proefschrift zien dat verschillende immunologische interacties tussen de vrouw en de partner, en de foetale antigenen afkomstig van de partner, een rol kunnen spelen in onverklaarde herhaalde miskramen. De uitdaging voor de toekomst is om deze immunologische interacties nader te onderzoeken om diagnostische markers te identificeren die kunnen dienen als hulpmiddel in de keuze van therapie, toegespitst op de individuele patiënt.

Literatuur

1.            Pandey MK, Rani R, Agrawal S. An update in recurrent spontaneous abortion. Archives of Gynecology and Obstetrics. 2005;272(2):95-108.

2.            Wilczynski JR. Immunological analogy between allograft rejection, recurrent abortion and pre-eclampsia – the same basic mechanism? Hum Immunol. 2006;67(7):492-511.

3.            Coulam CB. Epidemiology of recurrent spontaneous abortion. Am J Reprod Immunol. 1991;26(1):23-27.

4.            Branch DW, Gibson M, Silver RM. Clinical practice. Recurrent miscarriage. The New England journal of medicine. 2010;363(18):1740-1747.

5.            Larsen EC, Christiansen OB, Kolte AM, Macklon N. New insights into mechanisms behind miscarriage. BMC Med. 2013;11:154.

6.            Yang CJ, Stone P, Stewart AW. The epidemiology of recurrent miscarriage: a descriptive study of 1214 prepregnant women with recurrent miscarriage. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 2006;46(4):316-322.

7.            Clark P, Walker ID, Langhorne P, et al. SPIN (Scottish Pregnancy Intervention) study: a multicenter, randomized controlled trial of low-molecular-weight heparin and low-dose aspirin in women with recurrent miscarriage. Blood. 2010;115(21):4162-4167.

8.            Coomarasamy A, Williams H, Truchanowicz E, et al. PROMISE: first-trimester progesterone therapy in women with a history of unexplained recurrent miscarriages – a randomised, double-blind, placebo-controlled, international multicentre trial and economic evaluation. Health Technol Assess. 2016;20(41):1-92.

9.            Middeldorp S. Low-molecular-weight heparins have no place in recurrent miscarriage: debate–for the motion. Thrombosis research. 2011;127 Suppl 3:S105-109.

10.          Visser J, Ulander VM, Helmerhorst FM, et al. Thromboprophylaxis for recurrent miscarriage in women with or without thrombophilia. HABENOX: a randomised multicentre trial. Thromb Haemost. 2011;105(2):295-301.

11.          Kaandorp SP, Goddijn M, van der Post JA, et al. Aspirin plus heparin or aspirin alone in women with recurrent miscarriage. The New England journal of medicine. 2010;362(17):1586-1596.

12.          Badawy AM, Khiary M, Sherif LS, Hassan M, Ragab A, Abdelall I. Low-molecular weight heparin in patients with recurrent early miscarriages of unknown aetiology. Journal of obstetrics and gynaecology : the journal of the Institute of Obstetrics and Gynaecology. 2008;28(3):280-284.

13.          Fawzy M, Shokeir T, El-Tatongy M, Warda O, El-Refaiey AA, Mosbah A. Treatment options and pregnancy outcome in women with idiopathic recurrent miscarriage: a randomized placebo-controlled study. Arch Gynecol Obstet. 2008;278(1):33-38.

14.          Jivraj S, Makris M, Saravelos S, Li TC. Pregnancy outcome in women with factor V Leiden and recurrent miscarriage. Bjog. 2009;116(7):995-998.

15.          Moldenhauer LM, Diener KR, Thring DM, Brown MP, Hayball JD, Robertson SA. Cross-presentation of male seminal fluid antigens elicits T cell activation to initiate the female immune response to pregnancy. J Immunol. 2009;182(12):8080-8093.

16.          Zenclussen AC, Gerlof K, Zenclussen ML, et al. Abnormal T-cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion: adoptive transfer of pregnancy-induced CD4+CD25+ T regulatory cells prevents fetal rejection in a murine abortion model. Am J Pathol. 2005;166(3):811-822.

17.          Kelly RW. Immunosuppressive mechanisms in semen: implications for contraception. Hum Reprod. 1995;10(7):1686-1693.

18.          Politch JA, Tucker L, Bowman FP, Anderson DJ. Concentrations and significance of cytokines and other immunologic factors in semen of healthy fertile men. Hum Reprod. 2007;22(11):2928-2935.

19.          Koelman CA, Coumans AB, Nijman HW, Doxiadis II, Dekker GA, Claas FH. Correlation between oral sex and a low incidence of preeclampsia: a role for soluble HLA in seminal fluid? J Reprod Immunol. 2000;46(2):155-166.

20.          Baratelli F, Lin Y, Zhu L, et al. Prostaglandin E2 induces FOXP3 gene expression and T regulatory cell function in human CD4+ T cells. J Immunol. 2005;175(3):1483-1490.

21.          Sharkey DJ, Macpherson AM, Tremellen KP, Mottershead DG, Gilchrist RB, Robertson SA. TGF-beta mediates proinflammatory seminal fluid signaling in human cervical epithelial cells. J Immunol. 2012;189(2):1024-1035.